BIOKIMIA MEDIS: DIAGNOSA MUTAKHIR
DIAGNOSA MUTAKHIR
Diagnosa mutakhir merupakan diagnosa suatu penyakit dengan menggunakan mutakhir (modern). Diagnosa ini meliputi:
- - DNA Finger Print
- - PCR (Pollimerase Chain Reactin)
- - RFLP
- - RIA
- - ELISA
A. DNA Finger
Keragaman yang berdasarkan pada panjang dari hasil pemotongan DNA. Prinsipnya yaitu pemotongan DNA pada daerah tertentu dengan enzim restriksi yang telah dimodifikasi, tiap enzim mempunyai sisi pemotongan yang berbeda.
DNA forensic adalah metode analisis kejahatan forensik dengan menggunakan sampel DNA. Contoh kasus: Bom Bali, JW Mariot, pembuktian jasad Nurdin M Top.
Pencetakan sidik jari DNA” ( DNA - fingerprinting ) yang dalam dunia ilmiah lebih dikenal sebagai “Pemetaan Sidik Jari DNA “ ( DNA- Profiling ) telah memberikan cara untuk mengidentifikasi pelaku pemerkosaan dan pembunuhan dengan tingkat kepercayaan yang sangat tinggi.
Mengetahui Identitas Seseorang
Langkah-langkah mengetahui identitas seseorang:
1. Koleksi Spesimen Sampel
Sumber dapat diambil dari: pakaian, rekatan amplop ,putung rokok, tepi cangkir
Sampel yg diambil dpt berupa: darah, keringat, saliva cairan semen, rambut, kuku, otot,dll.
2. Bukti Biologi di Tempat Terjadinya Kejahatan
Pada dasarnya, perpindahan DNA secara langsung dari individu ke individu lain atau ke suatu objek dapat digunakan untuk menemukan tersangka suatu tindak kejahatan.
3. Ekstraksi DNA
Bukti biologi yang sudah ditemukan, kemudian molekul DNA harus dipisahkan dari materi sel lain sebelum diuji. Setelah dipisahkan kemudian di ekstraksi. Ekstraksi DNA disimpan secara khusus pda suhu -20oC, atau bahkan pada suhu -80oC pada penyimpanan dalam waktu lama, untuk menjaga aktifitas inti.
4. Preparasi sampel
- Gunakan sarung tangan disposable
- Gunakan instrumen disposable
- Hindari berbicara, bersin, dan batuk pd saat pengambilan sampel
- Hidari memegang barang bukti
- Pengeringan sebelum pembungkusan barang bukti
- Hindarkan dr suhu panas dan cahaya matahari langsung
- Ditambahkan agen anti clotting (EDTA)M
5. Ekstrak DNA
Ekstrak DNA dimurnikan dengan larutan detergent (SDS/ fenol chloroform) untuk menghilangkan material sel yg tidak diinginkan. Setelah itu dilakukan pengambilan DNA dari dalam sel. DNA kemudian disentrifugasi (pemisahan).
B. Analisis DNA
Analisis DNA bisa dilakukan dengan beberapa cara:
1. Analisis Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Analisi ini dilakukan dengan cara ditambahkan enzim endonuklease restriksi untuk memotong DNA. Target pada sekuens tertentu. Di elektroforesis untuk memisahkan potongan fragment DNA. Potongan DNA dengan berat molekul kecil akan lebih cepat bermigrasi (bp).
2. Southern Blot
Setelah di elektroforesis fragmen pd gel agarose ditransfer ke membran nitroselulosa. Cetakan pd nitroselulosa “fingerprint”. Diinkubasi dengan ditambahkan fragmen DNA radioaktif (probe) yang akan berhibridisasi dengan sampel. Probe yg tidak berhibridisasi akan dicuci dihilangkan . Dilihat di bawah sinar X (autordiograph).
3. PCR
Untuk mengamplifikasi DNA sampel yg jumlahnya sedikit. Digunakan Taq Polymerase untuk membangun nukleotida baru.
Alat: thermal cycler.
C. VNTRs Variable Number Tandenm Repeats (VNTRs)
Deretan basa berulang pada intron. VNTRs diwariskan dr orang tua, atau kombinasi dari kedua orang tua. Biasa dipakai untuk identifikasi anggota keluarga.
D. RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) atau Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi adalah suatu teknik untuk mengetahui perbedaan antar organisme dengan analisis pola yang berasal dari pembelahan DNA.
RFLP dapat diaplikasikan dalam hal-hal berikut:
o RFLP dapat digunakan dalam kasus paternitas atau kasus kriminal untuk menentukan sumber sampel DNA, biasanya dalam hal forensik.
o RFLP dapat digunakan untuk menentukan status penyakit dari suatu individu.
o RFLP dapat digunakan untuk mengukur tingkat rekombinasi yang dapat mengarah kepada peta genetik dengan jarak antara lokus RFLP, diukur dalam centi Morgans (cM: unit yang digunakan untuk mengukur tingkat hubungan genetik).
Pada situasi pelacakan forensik konvensional buntu, akibat ciri biometri rusak, pelacakan dengan tes DNA masih dapat diharapkan membantu. Tes DNA juga dimanfaatkan untuk melacak risiko penyakit keturunan. Ledakan bom di depan kedutaan Australia di Jakarta beberapa bulan lalu, mencuatkan tema tes DNA, untuk identifikasi jatidiri korban yang hancur.
1. Sampel analisa sidik jari DNA
Sampel dapat berupa: darah, kulit, rambut, sperma.
2. Prinsip Kerja RFLP
Pemotongan DNA pada daerah tertentu dengan enzim restriksi yang telah dimodifikasi, tiap enzim mempunyai sisi pemotongan yang berbeda.
3. Fungsi RFLP
Genotyping, forensic, tes keturunan, diagnosa penyakit keturunan dan lain-lain.
Tahap :
• Isolasi DNA
• Penambahan Enzim Restriksi
• Pemisahan fragmen DNA dengan gel elektroforesa
• Pemberian marker
• Pembandingan
Enzim restriksi yang dapat digunakan; ECO RI, Xho I, HIND III, Bam HI
E. RIA (RADIO IMMUNO ASSAY)
Teknik yang sangat sensitive yang digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen (misalnya kadar hormone dalam darah) tanpa perlu menggunakan bioassay. Sangat sensitive dan sangat spesifik, memerlukan peralatan khusus dan mahal serta memerlukan Tindakan khusus, karena yang digunakan adalah zat radioaktif.
PRINSIP:
Persaingan reaksi dalam campuran yang terdiri antigen/hormone berlabel radioaktif, antibody dan antigen/hormone yang tidak berlabel radioisotope. Antigen radioaktif dicampur dengan sejumlah antibody. Antigen dan antibody berikatan satu sama lain menjadi satu zat.
METODOLOGI/ANALISIS RIA
Analisis didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen (Ag) dan antibodi (Ab).
Digunakan secara kualitatif maupun kuantitatif.
Menggunakan “label” untuk memprediksi/melihat reaksi-reaksi yang terjadi.
KOMPONEN PENGUJIAN RIA
Ò Obat
Ò Antibodi
Ò Obat berlabel (labeled drug)
PROSEDUR UNTUK ANALISIS PADA RIA
o Sampel mengandung campuran obat dengan jumlah obat berlabel dan antibodi tetap
o Biarkan untuk seimbang dengan cara diinkubasi
o Pemisahan obat terikat antibodi dari obat tidak terikat
-Adsorpsi antibodi menggunakan arang (dan obat terikat)
-Pengendapan antibodi yang terikat obat
-Antibodi yang berikatan berada di dasar wadah
o Mengukur radioaktivitas (obat berlabel yang berikatan)
-Konsentrasi obat yang rendah berarti lebih banyak obat yang terikat dengan antibodi dan aktivitas radioaktif yang tinggi
-Konsentrasi obat yang tinggi berarti lebih sedikit obat yang berikatan dan aktivitas radioaktifrendah
o Menentukan kurva standar
-Logit-log konsentrasi adalah linear
-Non-linear plot radioaktif dengan konsentrasi
PEMANFAATAN RIA
o Diagnosis Varisela (cacar air), yaitu untuk mendeteksi keberadaan virus
o Deteksi Nefropati Diabetik (penyakit ginjal kronik)
o Uji kehamilan
F. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Prinsip dasar ELISA:
1. Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter.
2. Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel).
3. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatu substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
a) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastic dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
b) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagaiblocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
c) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
d) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
e) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
f) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
g) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
h) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.
1. ELISA Direct
Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.
2. ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan.
Prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
Kelebihan: tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector.
Kekurangan: teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda) .
3. ELISA Kompetitif
Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang mikrotiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.
APLIKASI TEKNIK ELISA:
1. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus
2. Pengukuran level hormone
3. Pendeteksi infeksi
4. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.
5. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatan terlarang.
No comments: